科研干货｜溶瘤病毒临床生产及质量控制

溶瘤病毒（OVs）是一类天然的或经基因工程改造的，可选择性地在肿瘤组织内复制，进而感染杀伤肿瘤细胞或导致肿瘤细胞裂解，但对正常组织无杀伤作用的病毒。

最初人们对使用病毒治疗癌症的兴趣可以追溯到20世纪早期，科学家观察到天然病毒感染下肿瘤消退的现象。然而，受到病毒致病性和相关毒性的影响，这种方法在当时的可行性受到限制。近年来，基因工程技术的最新进展使得溶瘤病毒（OV）的安全性和功效得到增强，促使人们拾起对溶瘤病毒疗法（OVT）的兴趣。

2015年，Talimogene laherparepvec（T-VEC）成为首个被FDA批准的溶瘤病毒，用于恶性黑色素瘤的治疗。目前，许多不同的OV正在临床试验评估中，包括腺病毒（AdV）、单纯疱疹病毒（HSV）、痘苗病毒、新城疫病毒、麻疹病毒和呼肠孤病毒，已被证明具有肿瘤特异性，相对无毒，能够诱导强大的抗肿瘤免疫力。

一、抗肿瘤免疫应答

OV通过直接和间接机制介导肿瘤细胞死亡，起到直接细胞毒性剂和治疗性癌症疫苗的作用。

这些机制与许多OV倾向于诱导肿瘤细胞死亡的免疫原性形式相关，包括免疫原性的细胞凋亡（apoptosis）、坏死（necrosis）、焦亡（Pyroptosis）和自噬（autophagy），促使抗肿瘤免疫应答的激活。

免疫原性细胞死亡（ICD）的特征是钙网蛋白和热休克蛋白的细胞表面暴露和免疫刺激分子如ATP、尿酸和高迁移率组框1的释放。不同于正常的细胞凋亡（非免疫原性），ICD可以通过树突状细胞（DC）的激活来诱导抗肿瘤免疫应答。此外，肿瘤细胞的ICD也释放了肿瘤相关抗原（TAA），激活抗原特异性抗肿瘤免疫应答。

二、对肿瘤细胞的杀伤机制

溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤机制主要包括以下6点：

直接裂解肿瘤细胞：病毒在肿瘤细胞中大量复制并裂解细胞，当肿瘤细胞在病毒的感染下破裂死亡时，释放的病毒颗粒进一步感染周围的肿瘤细胞。

原位疫苗和远端效应：肿瘤细胞的裂解导致肿瘤相关抗原(tumor-asso-ciated antigen，TAA)的大量释放，进而召募更多树突状细胞(DC)等免疫细胞浸润到肿瘤局部，激活抗肿瘤免疫应答，起到“原位疫苗”的作用。溶瘤病毒还可以通过交叉提呈作用，利用“原位疫苗”促使远端未受感染的转移灶消退，产生“远端效应”。

诱导固有免疫：细胞内或表面存在受体(如Toll样受体)，可以识别病毒的核酸或蛋白，诱导细胞因子的表达，表达的细胞因子与其他细胞上的受体结合，导致抗病毒基因的表达和免疫细胞的招募。

激发适应性免疫应答：病毒裂解肿瘤细胞后，释放的肿瘤特异性抗原被DC提呈，DC细胞招募并活化CD8+ 、CD4+T细胞，进而诱导抗原特异性T细胞杀伤。

破坏肿瘤血管系统：肿瘤的生长依赖肿瘤血管系统提供营养物质，因此，如果能破坏肿瘤血管系统，就能够有效地抑制肿瘤的生长。相比于其他治疗方法，溶瘤病毒破坏肿瘤血管的特点使其在肿瘤治疗方面具有明显的优势。研究表明，水泡性口炎溶瘤病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）通过静脉给药的方式可以在体内直接感染并破坏肿瘤血管，而对正常血管没有影响。

改善抑制性微环境：肿瘤在免疫系统的压力下，逐渐形成了高度复杂的肿瘤微环境，其中含有大量的免疫抑制性细胞如免疫调节T细胞(Treg)和髓源性抑制细胞 (MDSC)、免疫抑制性细胞因子如IL-10、免疫抑制性分子如PD-L1等，这些因素可以维持肿瘤抑制性的微环境促进肿瘤生长、帮助肿瘤逃逸。溶瘤病毒不仅可以打破肿瘤微环境的现有解剖结构，还能打破肿瘤抑制性的肿瘤微环境，为其他免疫疗法创造良好的微环境条件。表达特定细胞因子的溶瘤病毒，不仅可以达到裂解肿瘤细胞的目的，且可以提高抗肿瘤免疫，具有双重疗效。

三、生产过程质量控制

溶瘤病毒项目进入临床需经历的主要阶段，从新型溶瘤病毒药物治疗效率概念验证的临床前研究开始，锁定知识产权（提交专利文件）是成功寻求资金所必需的，特别是考虑到在GMP条件下进行生成的所需的高昂成本以及随之而来的挑战，必需有合适的工业化合作伙伴。使用合适的动物模型以进行物理学和毒理学研究，以证实溶瘤病毒的安全性是想监管机构递交研究型新药（IND）申请的前提，其需包括临床级溶瘤病毒生产和检测的所有信息。

溶瘤病毒的活性复制特性对监管和生产形成了独特的挑战。大多数病毒在组织培养中增殖，且要求高滴度病毒生产、外源性病原体检测以及评估病毒纯度和复制潜力的方法。所以，必须考虑生产和灌装过程中的实验室安全问题、产品验证和纯度以及细胞培养获得的生物制品的质量设计。

临床级AAV基因治疗载体特性质量控制检测策略的示例。载体使用经认证的原材料、成分和试剂，通过良好确定的生产工艺生产，以始终一致地达到最佳的载体产物纯度、效价和安全性。对生产过程中的每一步进行质量控制检测，包括所有产物中间体的工艺评估以及在关键步骤的额外检测，后者包括粗细胞收获液、载体原液以及终产物。此处所示的载体鉴定检测策略中，对载体原液和终产物阶段需进行多个Qp检测项目。