实验干货 | 荧光定量PCR应用解读

荧光定量 PCR（Real-time PCR），是指在 PCR 扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

以探针法荧光定量 PCR 为例：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合在 DNA 任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR 扩增时，Taq 酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。

传统的 PCR 进行检测时，扩增反应后需要进行染色处理及电泳分离，并且只能作定性分析，不能准确定量，易造成污染出现假阳性，使其应用受到限制。实时定量 PCR 技术不仅实现了对模板的定量，且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特点，使得荧光定量 PCR 逐渐取代常规 PCR。 

在 PCR 扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线，这条线是可以自动生成也可以手动设置的。之后反应会进入指数增长期，这个期间扩增曲线具有高度重复性，在该期间，可设定一条荧光阈值线，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般会将荧光阈值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为 Ct值，这个值与起始浓度的对数成线性关系，且该值具有重现性。

Ct值的意义

Ct 值最大的意义就是用来计算目的基因的表达量，此时就有两个概念容易被提及，那就是绝对定量和相对定量，绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

Ct 值诚然可以被利用来计算这两种定量结果，但是绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。绝对标准品制作困难难以获取，实验室基本都是选择相对定量的方法来计算相对基因表达量。

荧光定量 PCR 中的对照

对照的目的是对检测的各个环节进行监控，下面看看各个环节都可以使用哪些对照？

1. 阳性对照和阴性对照

阳性对照和阴性对照是指在相同的处理条件下，比如一份已知的感染样品和一份已知的未感染样品，都进行了提取和扩增最终获得了阳性结果和阴性结果。阴阳性对照强调处理过程与样品一致，并且有明确的预期结果。

2. 扩增对照

我们通常说的阳性对照和阴性对照指的是扩增试剂盒中附带的不需要提取的阳性对照和阴性对照，更准确的定义应该是扩增阳性对照和扩增阴性对照。扩增阳性对照含有阳性扩增模板，扩增阴性对照应含有阴性扩增模板（基质核酸）。扩增对照只能监控每次扩增过程中的扩增系统是否正常，不能监控采样、提取和每份样品的操作过程。如果是检测 RNA 样品的检测试剂盒，其扩增阳性对照使用质粒，便无法监控反转录过程。

3. 内标（Internal Control，IC）

内标是指在同一反应管中与靶序列共同扩增的一段非靶序列分子。内标有两种形式，一种是使用天然样品中含有的内参基因作为内标，另一种是人工添加的内标。内标的最大特点是与靶序列共同扩增，而其他的对照都是独立扩增。

3.1 内参基因

通常它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。内参基因通常是持家基因（house-keeping gene）因为其表达水平受环境因素影响较小，而且在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达变化很小。常用的内参基因包括 GAPDH、β-actin (BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT 和 TBP 等。

内参基因的优点是与样品中的靶基因经历完全相同的处理程序，可以监控采样，运输，核酸提取和扩增的全部过程。缺点是不同物种，不同生理状态下，不同组织中的内参基因存在一定的差异。如果样品类型是口腔液，咽拭子等样品，内参基因的量很低可能导致实验不成立。如果检测的是环境样品则内参基因可能完全失效。

3.2 人工内标

添加一种不会干扰靶序列扩增的人工合成的内标。现在国外的诊断试剂盒大部分都会将内标直接添加在反应液中与模板一起扩增，但是这样的内标不能监控采样，运输和核酸提取的过程。

还有另一种形式的内标，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份样品中加入等量的内标，这样就可以监控样品的提取到扩增的过程。但是由于是人工添加到样品中，仍然不能监控胞内细菌病毒的释放情况。

4. 核酸提取对照

可以使用内参基因，假病毒混合基质，灭活病毒混合基质来监控提取到扩增的流程。

5. 反转录对照（RT control）

可以使用提取好的 RNA 内参基因，RNA 假病毒混合基质，灭活 RNA 病毒混合基质来监控反转录到扩增的流程。

无反转录对照（no-RT control）含有除反转录酶以外的所有成分。

6. 空白对照（Blank control）

6.1 无模板空白对照

NTC 是指不含有模板（阳性模板或者阴性模板）的对照。目前的试剂盒的 NC 一般都是水或阴性缓冲液，所以 NC 等同于 NTC。其实两者有不同的作用。

6.2 仪器空白对照

NTC 是含有引物探针和反应液主要监控引物探针，反应体系有没有被污染。这里的仪器空白对照我通常使用的是空反应管来监控仪器有无非特异性的荧光信号。

6.3 荧光染料对照

最常使用的是 ROX 染料，由于荧光定量 PCR 的荧光信号在每个样品孔会有微小的差异所以使用特定的 ROX 荧光染料，系统可以根据 ROX 荧光染料的信号值来校准每孔的荧光信号。

7. 质控品（Quality control, QC）

上述环节中使用的各种对照大部分是试剂厂家匹配试剂盒使用的产品，有的是实验室自制，所以整个的监控过程可能存在不够客观和独立。因此在实验室的对照设置中每次检测都建议使用第三方质控品，有条件的使用国家有证标准物质 (Reference material ,RM)。由于标准物质具有准确量值和计量溯源性，可以更准确的评估整个试验流程的准确度。

8. 定值参考品

医学上的定量检测试剂盒，需要配套定值参考品用于试剂盒的定量检测使用。

没有一种对照是完美的，在检测中我们要根据自己的需求来进行灵活选择和搭配。

荧光定量PCR的应用   

荧光定量PCR作为一种高灵敏、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于生命科学、医学、食品安全等领域。以下是荧光定量PCR的一些主要应用：

01疾病诊断：

荧光定量PCR在病原体检测方面具有显著优势，可针对病毒、细菌、真菌等病原体进行快速、准确的定量分析。如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒等感染性疾病的早期诊断。

02基因表达分析：

通过荧光定量PCR技术，可对基因表达水平进行定量分析，有助于揭示基因在不同生物体、组织、细胞类型及生长发育过程中的功能及调控机制。

03基因突变检测：

荧光定量PCR可用于检测基因突变，如单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失突变等。在遗传病诊断、肿瘤个体化治疗等领域具有重要应用价值。

04转基因成分检测：

荧光定量PCR技术可用于检测食品、农作物中的转基因成分，为食品安全提供保障。

05微生物定量分析：

在环境监测、食品卫生、生物制药等领域，荧光定量PCR可用于细菌、真菌等微生物的定量分析，为质量控制提供依据。

06基因编辑评估：

在基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）应用中，荧光定量PCR可用于评估基因敲除、插入等编辑效果。

07药物研发：

荧光定量PCR技术在药物靶点筛选、药效评估、药物代谢研究等方面具有重要作用。

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荧光定量PCR作为一种高效、可靠的核酸检测手段，为生物学研究、疾病诊断、食品安全等领域提供了强大的技术支持。随着科技的不断发展，荧光定量PCR技术在未来的应用前景将更加广泛。

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